光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)儀器光學(xué)系統(tǒng)

        光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)知識(shí)；顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng) 顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡、反射鏡和聚光鏡四部分。從廣義上講，它還包括光源、過(guò)濾器、蓋玻片和載玻片。 (1)物鏡物鏡是決定顯微鏡性能的最重要的部件。它安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，靠近被觀察物體，故稱為物鏡或連接物鏡。一、物鏡分類物鏡根據(jù)使用條件的不同，可分為干式物鏡和浸入式物鏡；浸沒物鏡可進(jìn)一步分為水浸物鏡和油浸物鏡（常用的放大倍數(shù)為90-100倍）。根據(jù)放大倍數(shù)的不同，可分為低倍物鏡（10倍以下）、中倍物鏡（20倍左右）和高倍物鏡（40-65倍）。根據(jù)像差校正情況，分為消色差物鏡（常用，可以校正光譜中兩種顏色的色差）和多色物鏡（可以校正光譜中三種顏色的色差的物鏡）。頻譜，這是昂貴且較少使用的）。光學(xué)顯微鏡 2、物鏡的主要參數(shù)：物鏡的主要參數(shù)包括：放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和工作距離。 ①.放大倍數(shù)是指人眼看到的圖像尺寸與相應(yīng)標(biāo)本尺寸的比值。它是指長(zhǎng)度的比例而不是面積的比例。示例：放大倍數(shù)為 100 倍，指長(zhǎng)度為 1μm 的試樣。放大圖像的長(zhǎng)度為100μm。如果按面積計(jì)算，則放大10000倍。顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。 ②.數(shù)值孔徑又稱透鏡孔徑比，簡(jiǎn)稱NA或A，是物鏡和聚光鏡的主要參數(shù)，與顯微鏡的分辨率成正比。干物鏡的數(shù)值孔徑為0.05-0.95，油浸物鏡（雪松油）的數(shù)值孔徑為1.25。 ③.工作距離是指當(dāng)被觀察的試樣清晰時(shí)，物鏡前透鏡底部到試樣蓋玻片頂部的距離。物鏡的工作距離與物鏡的焦距有關(guān)。物鏡焦距越長(zhǎng)，放大倍數(shù)越低，工作距離越長(zhǎng)。示例：10x 物鏡標(biāo)有 10/0.25 和 160/0.17，其中 10 是物鏡的放大倍數(shù)； 0.25 是數(shù)值孔徑； 160為鏡筒長(zhǎng)度（mm）； 0.17 是蓋板玻璃的標(biāo)準(zhǔn)厚度（以毫米為單位））。 10倍物鏡有效工作距離為6.5mm，40倍物鏡有效工作距離為0.48 毫米。光學(xué)顯微鏡 3. 物鏡的作用是對(duì)試樣進(jìn)行次放大。它是決定顯微鏡性能的最重要的組成部分——分辨率的高低。分辨力也稱為分辨力或分辨力。分辨率的大小用分辨率距離（可分辨的兩個(gè)物點(diǎn)之間的最小距離）的值來(lái)表示。在明視距離（25cm），正常人眼可以看到相距0.073mm的兩個(gè)物點(diǎn)。這個(gè)0.073mm的值就是正常人眼的分辨距離。顯微鏡的分辨率距離越小，分辨率越高，這意味著它的性能越好。顯微鏡的分辨力由物鏡的分辨力決定，物鏡的分辨力由其數(shù)值孔徑和照明光的波長(zhǎng)決定。當(dāng)使用普通*照明法（使光線均勻穿過(guò)試樣的明視照明法）時(shí)，顯微鏡的分辨距離為d=0.61λ/NA，其中d為物鏡的分辨距離，單位為nm。 λ——照明光的波長(zhǎng)，nm。 NA——物鏡的數(shù)值孔徑。例如油浸物鏡的數(shù)值孔徑為1.25，可見光波長(zhǎng)范圍為400-700nm，平均波長(zhǎng)為550nm，則d=270nm，約為照明光波長(zhǎng)的一半.一般可見光照射顯微鏡的分辨率極限為0.2μm。 (2)目鏡光學(xué)顯微鏡由于靠近觀察者的眼睛，所以又稱為目鏡。安裝在鏡筒的上端。 1、目鏡的結(jié)構(gòu)通常由上下兩組鏡片組成。上面的透鏡稱為眼透鏡，下面的透鏡稱為會(huì)聚透鏡或場(chǎng)透鏡。上下透鏡之間或場(chǎng)鏡下方安裝一個(gè)光闌（它的大小決定了視場(chǎng)的大?。?，因?yàn)闃?biāo)本只是在光闌表面成像，可以在這個(gè)光闌上粘一小塊頭發(fā)作為一個(gè)指針來(lái)指示某個(gè)特征的目標(biāo)。目鏡千分尺也可以放置在其上以測(cè)量觀察到的樣品的尺寸。目鏡長(zhǎng)度越短，放大倍數(shù)越大（因?yàn)槟跨R的放大倍數(shù)與目鏡焦距成反比）。 2、目鏡的作用是將物鏡放大后清晰分辨的實(shí)像進(jìn)一步放大到人眼能輕易分辨清楚的程度。常用目鏡的放大倍數(shù)為5-16倍。 3、目鏡與物鏡的關(guān)系 光學(xué)顯微鏡物鏡已經(jīng)過(guò)能分辨清楚的精細(xì)結(jié)構(gòu)，若不經(jīng)目鏡重新放大，達(dá)不到人眼能分辨的大小，則不清晰；但是物鏡無(wú)法分辨的精細(xì)結(jié)構(gòu)，即使用高倍目鏡重新放大，仍然看不清楚，所以目鏡只能放大，不會(huì)提高分辨率顯微鏡。有時(shí)雖然物鏡可以區(qū)分非?？拷膬蓚€(gè)物點(diǎn)，但兩個(gè)物點(diǎn)之間的像距小于人眼的分辨距離，仍然無(wú)法看清。因此，目鏡和物鏡是相互制約的。 (3) 集中器 集中器又稱集中器。位于樣品下方的冷凝器支架上。它主要由聚光鏡和可變光闌組成。其中，聚光鏡可分為明場(chǎng)聚光鏡（普通顯微鏡配置）和暗場(chǎng)聚光鏡。 1.光透鏡的主要參數(shù)數(shù)值孔徑（NA）是聚光鏡的主要參數(shù)，數(shù)值孔徑一般為1.2-1.4，數(shù)值孔徑有一定的可變范圍，通常是刻在上透鏡上的數(shù)字frame表示光圈值，通過(guò)調(diào)節(jié)下可變光圈的開度，可以得到低于這個(gè)數(shù)值的各種數(shù)值孔徑，以滿足不同物鏡的需要。一些聚光鏡由幾組透鏡組成?？梢詫⒆钌厦娴囊唤M透鏡移出或移出光路，使聚光鏡的數(shù)值孔徑更小，以適應(yīng)低倍物鏡觀察的照明。光學(xué)顯微鏡 2. 聚光鏡的作用 聚光鏡相當(dāng)于一個(gè)凸透鏡，它會(huì)聚光以增強(qiáng)試樣的照度。一般聚光鏡的聚光焦點(diǎn)設(shè)計(jì)在上透鏡平面上方1.25mm左右。 （焦點(diǎn)在待觀察的標(biāo)本上，載玻片的厚度約為1.1mm） 3. 虹膜隔膜又稱虹膜。它位于冷凝器下方，由十幾個(gè)金屬片組成，中間有一個(gè)圓孔。它的作用是調(diào)節(jié)光強(qiáng)，使聚光器的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑相適應(yīng)。光圈開得越大，數(shù)值孔徑越大（觀察后應(yīng)將光圈調(diào)到）。在虹膜下方，有一個(gè)圓形濾光片支架。注：中學(xué)實(shí)驗(yàn)室僅教師用顯微鏡（1600×或1500×）配備聚光鏡，學(xué)生用顯微鏡（640×或500×）配備旋轉(zhuǎn)光闌。靠近舞臺(tái)底部，一個(gè)能夠旋轉(zhuǎn)的圓盤，旋轉(zhuǎn)光圈（也叫快門），光圈有大小不一的圓孔，稱為孔。直徑分別為2、3、6、12、16mm。旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)隔膜。光闌上的每個(gè)光闌都可以與光孔對(duì)齊，通過(guò)不同大小的孔徑可以調(diào)節(jié)光強(qiáng)。 (4) Reflector Reflector為可隨意旋轉(zhuǎn)的雙面鏡，直徑為50mm。一側(cè)是平的，另一側(cè)是凹的。它的作用是通過(guò)光孔反射來(lái)自任何方向的光。平面鏡反光能力弱，光線強(qiáng)時(shí)使用，凹面鏡反光能力強(qiáng)，光線弱時(shí)使用。反射器通常一側(cè)是平面鏡，另一側(cè)是凹面鏡。它安裝在冷凝器下方，可以水平和垂直方向旋轉(zhuǎn)。反射器的作用是使光源發(fā)出的光或自然光到達(dá)聚光器。使用聚光鏡時(shí)一般使用平面鏡，不用時(shí)使用凹面鏡；光線強(qiáng)時(shí)使用平面鏡，光線弱時(shí)使用凹面鏡。觀察后，反射器應(yīng)垂直放置。 (5)照明光源顯微鏡的照明可以使用自然光源或人造光源。自然光源光來(lái)自天空，被白云反射。請(qǐng)勿使用陽(yáng)光直射。 2.人造光源①。對(duì)人造光源的基本要求：有足夠的發(fā)光強(qiáng)度；光源不能產(chǎn)生過(guò)多的熱量。 ②常用人造光源：顯微鏡燈；熒光燈 (6) 濾光器安裝在光源和聚光器之間。作用是讓選定的某一波段的光通過(guò)，而吸收其他光，即改變光的光譜成分或減弱光的強(qiáng)度。分為兩類：過(guò)濾器和液體過(guò)濾器。 (7) 蓋玻片和載玻片蓋玻片和載玻片的表面應(yīng)相當(dāng)平整，無(wú)氣泡和劃痕。選擇無(wú)色、透明性好的，使用前洗凈。蓋板玻璃的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17±0.02mm。如果不使用蓋板玻璃或蓋板玻璃厚度不合適，都會(huì)影響成像質(zhì)量。載玻片標(biāo)準(zhǔn)厚度為1.1±0.04mm，一般使用范圍為1-1.2mm。如果太厚，會(huì)影響冷凝器的性能，如果太薄，則容易破裂。